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              直接PCR技術,讓PCR更簡單

              直接PCRDirect PCR)是一種不經核酸提取而直接使用動物或植物組織等直接進行擴增的反應。在許多方面,直接PCR的工作方式類似于常規PCR。

               

               

               

              主要區別是直接PCR中使用的定制緩沖液,樣本可不經過核酸抽提,直接進行PCR反應,但對于參與直接PCR反應的酶的耐受性和buffer的兼容性有相對應的要求。

               

               

               

              盡管常見的樣品中或多或少都會存在PCR抑制劑,但在酶和buffer的作用下直接PCR仍可實現可靠的擴增。而傳統的PCR反應需要以高質量的核酸為模板進行反應,如模板中含有蛋白以及其他雜質時就會抑制PCR反應的順利進行。直接PCR是目前分子診斷領域比較熱門的技術之一。

               

               

               

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              直接PCR最初用于動植物

               

               

               

              直接PCR最早應用的領域是動植物領域,比如鼠、貓、雞、兔、羊、牛等動物的血液、組織和毛發;植物的葉片和種子等,用來研究基因分型、轉基因、質粒檢測、基因敲除分析、DNA來源鑒定、物種鑒定、SNP分析等領域。

               

               

               

              這些領域有一些共同的特點,那就是目標基因的含量比較高,核酸提取麻煩,所以直接PCR不僅能夠節省時間,對結果的影響很小,同時也能節省成本。

               

               

               

              直接PCR用于病原體檢測,是近幾年的事,部分PCR試劑廠商在做創新的時候朝著這個方向做了很多的努力,尤其是這次新冠疫情,市場上出現了很多這樣的檢測產品!

               

               

               

              02

              直接PCR需要的試劑

               

               

               

              樣本裂解液

               

              樣本裂解液可以自己配置,也可以購置。不同品牌裂解液組份的差異會使得裂解能力各有不同,進而裂解時間稍有差異。比如說動物組織樣本制備,一般推薦30min或過夜裂解,針對病毒類的裂解液在3-10min不等。

               

               

               

              PCR master mix

               

              建議使用熱啟動DNA聚合酶,增強特異性擴增,擴增能力也更強。直接PCR的核心就是具有高度耐受的聚合酶。

               

               

               

              清除或抑制樣本中影響DNA擴增的組份

               

              樣本在經過裂解液處理之后,會釋放出蛋白質、脂質和其他細胞碎片,這些物質會抑制PCR反應,因此直接PCR需要加入相應的清除或者抑制劑來減弱這部分因素的影響。

               

               

               

              03

              直接PCR五大知識點薈萃

               

               

               

              第一、Direct PCR技術是針對各類生物樣品的直接PCR技術。該技術條件下,無需對核酸進行分離提取,直接以組織樣本為對象,加入目標基因引物進行PCR反應。

               

               

               

              第二、Direct PCR技術不僅僅是傳統的DNA模版的擴增技術,也包含RNA模版的逆轉錄PCR。

               

               

               

              第三、Direct PCR技術不僅僅是直接對組織樣本進行常規定性PCR反應,還包括Real-Time qPCR反應,這就要求反應體系具備極強的抗背景熒光干擾能力以及對內源性熒光淬滅劑的拮抗能力。

               

               

               

              第四、Direct PCR技術針對的樣本,只需要核酸模版的釋放,并不對干擾PCR反應的蛋白、多糖、鹽離子等進行去除,這要求反應體系中的核酸聚合酶和PCR Mix具有極佳的抗逆性和適應性,能夠在復雜的條件下保證酶活性和復制準確性。

               

               

               

              第五、Direct PCR技術針對的組織樣品未經任何核酸富集處理,模版量極少,這就要求反應體系有極高的靈敏度和擴增效率。

               

               

               

              參考資料:翊圣生物、賽默飛生命科學等

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